Wikipedista:Svarberb/ITCH

ITCH je protein kódovaný genem ITCH. Jedná se o E3 ubikvitin ligázu patřící do rodiny NEDD4. Alternativně ji můžeme znát pod jmény Atrophin-1-interacting protein 4 (AIP4) nebo NFE2-associated polypeptide1 (NAPP1). Jedná se o enzym, který má významnou funkci v rámci fungování imunitního systému.

Deficience této E3 ubikvitin ligázy u myší způsobuje vývoj zánětlivého onemocnění, které nese charakteristiky nemoci zprostředkované Th2 lymfocyty a jejich imunitní odpovědí. Při tomto onemocnění dochází k zánětu kůže, zažívacího traktu, plic a také ke zvýšení hladiny autoprotilátek v séru. Histologické vyšetření kůže ukazuje, že do plic těchto myší migrují lymfocyty a makrofágové, dochází k hyperkeratóze. Plíce zase trpí infiltrací lymfocytů, eozinofilů a fibrotizací plic. ITCH-deficientní myši si také rozvíjejí závažnou kolitidu s krvácením do konečníku, ztluštěním stěny tlustého střeva, destrukcí střevních krypt a střevního epitelu. střevní sliznice je postižena zánětlivým infiltrátem obsahující neutrofily a mononukleární buňky.

Struktura

E3 ubikvitin ligáza ITCH se, stejně jako ostatní členové rodiny NEDD4, skládá z C2 domény na N konci, 4 centrálních WW doména a katalytické HECT domény na C konci. C2 doména zprostředkovává vazbu na membránové fosfolipidy, když je aktivována zvýšením koncentrace vápenatých kationtů v buňce, a může tak ovlivnit buněčnou lokalizaci proteinu ITCH. WW domény jsou interakční domény obsahující 2 důležité tryptofany, mezi kterými se nachází 20 až 22 aminokyselin a které váží sekvence bohaté na prolin. Přes tyto WW domény se ITCH může vázat na své substráty a jiné proteiny, které mohou regulovat katalytickou aktivitu. Mezi takové proteiny patří třeba adaptorový proteiny NDFIP1, který pomáhá ITCH aktivovat. HECT doména je jedna z domén, které se nachází v E3 ubikvitin ligázách, a zprostředkovává napojení ubikvitinu na substrát. HECT doménu můžeme rozdělit na N-koncový a C-koncový lalok, které jsou spojené flexibilním úsekem. V rámci C-koncového laloku HECT domény se nachází katalytický cystein, na který se přenáší ubikvitin navázaný na E2 ubikvitin konjugační enzym, který interaguje s N-koncovým lalokem. Cystein v HECT doméně vytvoří disulfidickou vazbu s ubikvitinem a poté je přenesen na cílový substrát ^1,2.

Funkce

Regulace diferenciace T lymfocytů

E3 ubikvitin ligáza ITCH zprostředkovává své funkce pomocí ubikvitinace svých substrátů. Jeden z těchto substrátů je transkripční faktor JUNB, který je po své ubikvitinaci degradován. ITCH může fungovat také jako E3 NEDD8 ligáza, kdy na JUNB připojuje ubikvitinu podobný protein NEDD8. Neddylace JUNB také podporuje jeho degradaci 5. V nepřítomnosti ITCH se JUNB akumuluje v T lymfocytech a jako transkripční faktor podporuje expresi IL-4 a následnou diferenciaci naivních T lymfocytů na Th2 lymfocyty. Proto se plicích ITCH-deficientních myší nachází zvýšené procento aktivovaných CD4+ T lymfocytů, které produkují IL-4 a IL-5. ITCH se tak podílí na negativní regulaci diferenciace Th2 lymfocytů ^1,4.

Zánětlivé onemocnění ITCH-deficientních myší je ale vedle Th2 odpovědi zprostředkováno i Th17 odpovědí. U těchto myší například vidíme zvýšenou sérovou hladinu IL-17A a zvýšenou expresi IL-17A ve střevní sliznici. Mezi další substráty proteinu ITCH patří totiž transkripční faktor RORγT, který je zásadní pro vývoj a funkci Th17 lymfocytů. ITCH váže RORγT pomocí svých WW domén a zprostředkovává jeho ubikvitinaci, která vede k jeho degradaci. Degradací faktoru RORγT tak ITCH omezuje diferenciaci Th17 lymfocytů a produkci IL-17 ⁷. Mimo jiné se na podpoře diferenciace Th17 lymfocytů ITCH-deficientních myší podílí i zvýšená produkce IL-4. Tento cytokin indukuje diferenciaci Th2 lymfocytů, které zprostředkovávají zánětlivé onemocnění, při kterém dochází k zvýšení množství eozinofilů produkujících IL-6. Produkovaný IL-6 pak může podporovat diferenciaci Th17 lymfocytů ⁸. ITCH se také podílí na diferenciaci Tfh lymfocytů a tím i na produkci protilátek a afinitní maturaci B lymfocytů. Při diferenciaci Tfh lymfocytů ITCH ubikvitinuje a degraduje transkripční faktor FOXO1, který negativně reguluje tuto diferenciaci ¹².

ITCH se také podílí na podpoře aktivity a polarizace regulačních T lymfocytů. ITCH-deficientní T lymfocyty mají zhoršenou schopnost polarizovat na regulační T lymfocyty a jejich regulační T lymfocyty jsou méně funkční. Protein ITCH v T lymfocytech interaguje s transkripčním faktorem TIEG1 a ubikvitinuje ho, tato ubikvitinace aktivuje TIEG1 k tomu, aby podporoval expresi FOXP3 a polarizaci na regulační T lymfocyty ¹⁵. Dále ITCH ubikvitinuje a degraduje protein SMAD7, který negativně reguluje signalizaci přes TGFBR1. Podporuje tak signalizaci cytokinu TGF-beta a tím i polarizaci naivních T lymfocytů na regulační T lymfocyty ^{16, 17}.

Regulace signalizace povrchových receptorů

ITCH reguluje signalizaci několika povrchových receptorů na CD4+ T lymfocytech, které modulují jejich aktivitu. Mezi tyto receptory patří TCR, CTLA-4 a CXCR4. Na signalizaci TCR se podílí na vápenatých kationtech závislá fosfatáza Calcineurin, která podporuje expresi proteinu ITCH, který pak zprostředkovává degradaci PKC-omega a PLC-γ. Tyto enzymy jsou klíčové pro signalizaci TCR a jejich degradace podporuje vstup T lymfocytu do stavu anergie a destabilizaci imunologické synapse mezi anergizovaným T lymfocytem a APC ¹¹. Při aktivaci signalizace inhibičního receptoru CTLA-4 dochází ke snížení fosforylace proteinu ITCH, což podporuje jeho katalytickou aktivitu. Aktivita proteinu ITCH v tomto případě sníží produkci cytokinů IL-4 a IFN-γ po aktivaci receptoru CTLA-4 ⁹. Chemokinový receptor CXCR4 je regulován přímou ubikvitinaci pomocí proteinu ITCH. Po vazbě ligandu receptor CXCR4 dochází k fosforylaci jeho dvou serinů na C konci. Na tyto fosforylované seriny se váže ITCH pomocí svých WW domén a ubikvitinuje ho. Tato ubikvitinace poté indukuje transport CXCR4 do lysozomu, jeho degradaci a ukončení signalizace ¹⁰.

Regulace protilátkové imunitní odpovědi

V humorální imunitě ITCH působí jako negativní regulátor aktivace B lymfocytů. Po aktivaci B lymfocytu ITCH snižuje jeho proliferaci a aktivaci komplexu mTORC1. Zvýšená aktivita mTORC1 v ITCH-deficientních B lymfocytech vede po aktivaci ke zvýšení rychlosti glykolýzy a ke zvýšení maximální glykolytické kapacity. Tyto myši mají po imunizaci antigenem zvýšený počet antigen specifických plazmatických buněk a zvýšenou hladinu specifických protilátek v séru ¹³. ITCH je také důležitý pro správný vývoj B lymfocytů. Na vývoji B lymfocytů se podílí transkripční faktor FOXO1, který v B lymfocytech mimo jiné podporuje expresi proteinu ITCH. U ITCH-deficientních myší v B lymfocytech dochází k akumulaci JUNB, který indukuje expresi malé RNA mi-R182. mi-R182 pak sníží expresi FOXO1 a dochází k dysregulaci vývoje B lymfocytů ¹⁴.

Regulace vrozené imunitní odpovědi

ITCH dokáže inhibovat i prozánětlivé signální kaskády, které jsou důležité i pro vrozenou imunitu. Konkrétně hraje roli v negativní regulaci aktivace prozánětlivého transkripčního faktoru NF-kB. V tomto případě ITCH tvoří komplex s ubikvitin editačním proteinem A20. Tento komplex štěpí lineární polyubikvitinaci (vazba ubikvitinů přes K63) na proteinu RIP1 a zprostředkovává degradační ubikvitinaci (vazba ubikvitinů přes K48). RIP1 je tak degradován a dochází k umlčení signalizace NF-kB. Dále může ITCH tvořit komplex s deubikvitinázou CYLD po signalizaci prozánětlivým cytokinem TNFafla v makrofázích odvozených z kostní dřeně. Tento komplex funguje podobně jako komplex s A20, znova dochází k nahrazování lineární ubikvitinace za degradační ubikvitinaci, v tomto případě je ale takto modifikována kináza TAK1 a dochází ke snížení transkripce genů pro cytokiny IL-6, TNFalfa a IL-1beta. ITCH se také podílí na ubikvitnaci a degradaci TAB1 v makrofázích odvozených z kostní dřeně, což je protein vytvářející komplex s TAK1, ve kterém je tato kináza aktivní. TAB1 také podporuje TAK1-nezávislou aktivaci MAP kinázy p38alfa a degradace TAB1 pomocí E3 ubikvitin ligázy ITCH tedy negativně reguluje i aktivaci této MAP kinázy.

Při infekci buněk epitelu bakterií Listeria monocytogenes ITCH zprostředkovává lineární ubikvitinaci proteinu RIP2, který pak může interagovat s receptorem NOD2. Dochází tak ke změně aktivity NOD2, k inhibici aktivace NF-kB a k podpoře aktivace p38alfa. ITCH také může ubikvitinovat a degradovat CIAP, který podporuje fosforylaci RIP2 a signalizaci tohoto proteinu. ITCH takto snižuje produkci cytokinů.

Regulace

Za fyziologických podmínek je ITCH v autoinhibovaném stavu, kdy může vázat E2 ubikvitin konjugační enzym, ale nemůže modifikovat své substráty. Tohoto autoinhibovaného stavu je dosaženo tak, že se druhá WW doména a region, který následuje hned po této WW doméně, váží na HECT doménu v rámci jedné molekuly proteinu ITCH. Jedna z možností, jak uvolnit tuto autoinhibici a aktivovat ITCH, je pomocí adaptorového proteinu NDFIP1, který reguluje E3 ubikvitin ligázy z rodiny NEDD4. NDFIP1 se váže na WW domény proteinu ITCH pomocí svých PY motivů a znemožňuje mu zaujmout autoinhibovaný stav ^{18, 19}.

Aktivita E3 ubikvitin ligázy ITCH může být modulována fosforylací. K tomu dochází například při aktivaci T lymfocytu, kdy je ITCH fosforylován pomocí kinázy JNK. Při této fosforylaci dochází k aktivaci proteinu ITCH, který ubikvitinuje JUNB a snižuje tak expresi IL-4 ^{3, 19}.

ITCH v Lidském onemocnění

V roce 2010 byla vypracována studie, která poprvé popsala deficienci E3 ubikvitin ligázy ITCH u lidí. Tato studie popsala celkem deset pacientů, kteří měly v obou alelách pro ITCH mutaci, která posunula čtecí rámec, jehož následkem bylo vytvoření předčasného stop kodonu a neaktivního enzymu. Všichni pacienti trpěly chronickým zánětem, který se u 9 pacientů projevoval jako chronické plicní onemocnění podobné astmatu. Histologická analýza plic těchto pacientů odhalila infiltraci lymfocytů bez fibrotizace tkáně. K tomu ještě tito pacienti trpěly opakujícími se zápaly plic bez známé infekční příčiny. 6 z těchto pacientů si také vyvinulo autoprotilátky a jednu nebo více orgánově specifickou autoimunitní chorobu včetně autoimunitní hepatitidy, hypotyreoiditidy a diabetu prvního typu. Všech 10 pacientů také vykazovalo hepatosplenomegálii, poruchu růstu a zhoršení kognitivních funkcí. V roce 2019 vyšla studie popisující případ jednoroční dívky, který byla mutantní homozygot v genu kódující ITCH. Její mutantní alela kódovala ITCH bez funkční HECT domény. Toto dítě trpělo autoimunitní hepatitidou, diabetem prvního typu, tyreoiditidou a opakujícími se infekcemi respiračního traktu. Ve stejném roce byl popsán ještě případ jedné pacientky, který byla heterozygot nesoucí 2 různé mutace v genu kódující ITCH. Jedna jeho alela nesla mutaci v HECT doméně a druhá nesla mutaci pře WW doménami. Tato pacientka trpěla gastroezofageálním refluxem, chronickým plicním onemocněním a častými infekcemi respiračního traktu. Tyto případy nám ukazují, že společným prvkem mutací poškozující funkci proteinu ITCH je narušení funkce imunitního systému, které vede k náchylnosti na respirační infekce, orgánově specifickým autoimunitním chorobám a chronickému zánětu plic, který se podobá astmatu.